所谓Real-Time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。real-time PCR技术即实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。

实时荧光定量PCR 技术的主要应用

1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等；

2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及CDNA 芯片或差显结果的确证；

3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等。

Realtime PCR 常用的两种方法分别为Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe （探针法）。

SYBR green
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法适用于：

1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。

3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。

4、高通量大规模的定量PCR检测

5、专一性要求不高的定量PCR检测。

Taqman Probe
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

此方法适用于：

1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。

2、适用于扩增序列专一的体系的检测。

3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。

4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。

6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。